博士学位论文答辩公告甘蓝型油菜自交不

在甘蓝型油菜中，自交不亲和信号通路主要通过柱头表面的类受体激酶SRK（S-locusreceptorproteinkinase）介导，但是其下游信号分子的鉴定极为有限，目前只发现了ARC1（ArmadilloRepeatContaining1）介导的泛素化降解这一条路径。因此寻找SRK受体激酶下游信号分子对于完善自交不亲和信号通路具有重要意义。本研究通过酵母双杂交、基因克隆、表达分析、遗传转化、磷酸化蛋白质组等研究手段对自交不亲和下游的信号分子进行研究，取得的主要结果如下：

（1）.甘蓝型油菜自交不亲和磷酸化组学的研究

对自交不亲和材料‘W-3’的柱头授予亲和花粉与不亲和花粉提取总蛋白进行LC-MS/MS质谱的鉴定。最终鉴定到了个磷酸化肽段，来自于个蛋白（FDR0.01）。通过对差异的磷酸化蛋白进行分析发现了自交不亲和反应中有个磷酸化蛋白的表达水平发生变化，而亲和反应中只有个差异磷酸化蛋白，推测自交不亲和反应比亲和反应更加复杂。而且植物激素：如油菜素内酯、脱落酸、乙烯等信号通路相关基因参与到了自交不亲和反应中。

（2）.BnA5.ZML1是甘蓝型油菜自交不亲和反应中的亲和因子

利用酵母双杂交，鉴定到了一个与SRK互作的GATA类型的转录因子BnA5.ZML1。通过荧光定量PCR的分析表明亲和授粉后BnA5.ZML1的表达水平显著被诱导。利用CRISPR/Cas9技术获得了BnA5.ZML1功能缺失型突变体bna5.zml1：在亲和授粉后，bna5.zml1柱头上花粉的附着和花粉管穿过柱头的数目都显著的下降，导致其结实率下降。而过量表达BnA5.ZML1可以部分打破自交不亲和，说明了BnA5.ZML1是自交不亲和反应中的一个亲和因子。

SRK的表达量在BnA5.ZML1过表达材料中下调表达，而在bna5.zml1突变体中上调表达。LUC酶活实验结果证明了BnA5.ZML1抑制了SRK的表达，但是酵母单杂交及EMSA实验验证发现，BnA5.ZML1并不能直接结合在SRK启动子区域，表明BnA5.ZML1可能通过和其他蛋白互作，结合在SRK启动子上，抑制SRK基因的表达，从而打破了自交不亲和。亚细胞定为实验发现：当SRK不存在时，BnA5.ZML1主要是在细胞核中间表达，当SRK存在的时候，BnA5.ZML1的GFP信号与SRK的RFP有共定位，说明BnA5.ZML1可以出核且一部分与SRK共定位在质膜上。

（3）.SRK激酶结构域对传递自交不亲和信号的重要性

将GFP标签和FLAG标签分别融合在Ⅰ类SRK基因的C端和N端，用SRK自身启动子驱动，转化到Ⅱ类自交不亲和材料S70中，对这些转基因植株的亲和性分析结果表明：SRKC端融合GFP标签影响了SRK的活性，导致其不能正常传递自交不亲和信号。而其N端的融合蛋白FLAG-SRK可以在在Ⅱ类S70中成功表达，验证了Ⅰ类和Ⅱ类自交不亲和的信号通路具有保守性。

主要学术成果

1、ZhiqiangDuan,YataoZhang,JinxingTu,JinxiongShen,BinYi,TingdongFu,ChengDai*andChaozhiMa*.(）GATATranscriptionFactorBnaZML1IsaStigmaticCompatibilityFactorTargetedbytheSelf-In