鉴定甘蓝型油菜中调节角果发育的miRN
鉴定甘蓝型油菜中调节角果发育的miRNAs
Identi?cationofmiRNAsthatregulatesiliquedevelopmentinBrassicanapus
作者：LiChen,LeiChen,XiangxiangZhang,TingtingLiu,SailunNiu,JingWen,BinYi,ChaozhiMa,JinxingTu,TingdongFu,JinxiongShen*
单位：华中农业大学
期刊：PlantScience
时间：.1
IF:3.
DOI:10./j.plantsci..01.
研究背景
甘蓝型油菜（BrassicanapusL.）是起源于芜菁（Brassicarapa）和甘蓝（Brassicaoleracea）两个祖先的异源多倍体芸薹属物种。十字花科植物产生的非肉质果实称为角果，在胚珠受精后由雌蕊发育而来。几种角果相关性状已被证明与产量相关，如每株角果数（SP），每角果种子数（SPS）和种子重量（SW）。而通常角果长度（SL）与SPS和SW显著正相关，因此长角果是油菜高产量育种中一种优良性状，充分了解控制SL的遗传机制可能对提高油菜籽产量有重大意义。
内源非编码小RNAs是真核生物中转录水平和转录后水平基因表达的重要调节者，已被证实在包括细胞增殖、激素应答和胁迫反应的各项生物学进程中起关键作用。尽管许多研究已经调查了与器官大小相关的分子机制，但miRNAs在甘蓝型油菜中调控SL的作用在很大程度上还是未知的。
材料与方法
（一种长角果的自交系），（一种短角果株系的小孢子培养而来的双单倍体）；
实验样品来自x杂交的长角果（LS）和短角果（SS）的回交后代群体，授粉后0-7d采集LS和SS的雌蕊/角果（花开时采集雌蕊为0DAP），每个阶段采集~12株；
提取总RNA构建sRNA和降解组文库，Illumina平台测序。
主要结果
1.总的sRNA鉴定
本研究所用LS和SS株系在SL上表现出明显的差异（LS：8.25±0.28cm；SS：5.07±0.52cm，图1）。两个株系（各两个重复）0-7DAP角果混样sRNA测序的4个文库获得7.9-8.9millioncleanreads（表1）；sRNA序列主要是21-24nt，其中24nt序列最普遍（≥60%，图2）。
图1.LS和SS的角果长度（40DAP）
表1.小RNA和降解组测序的数据集汇总
图2.4个小RNA文库中21-24ntsRNAs的长度分布
2.已知和新的B.napusmiRNAs的鉴定
通过预测共获得种非冗余的miRNA前体；比对数据库确定了其中种代表了来自36个家族的65种已知miRNAs，包括50种鉴定为已知的芸薹属植物miRNAs，15种匹配其它植物物种。其它种miRNA前体代表种鉴定为新miRNA的uniquesRNA。
3.角果早期发育中miRNAs的表达分析
36个已知miRNA家族中，表达量最高的是miR，miR和miR。大多数新miRNAs表达量较低，但也有部分比保守miRNAs更高，可能是B.napus中尚未被鉴定出的独特miRNAs。共发现12个已知和5个新miRNAs在LS和SS株系间差异表达，其中9个的qRT-PCR与测序结果基本一致（表2，图3）。
表2.LS和SS中差异表达的已知和新miRNAs
图3.所选9个角果中miRNAs在LS和SS之间的qRT-PCR分析
4.基于降解组测序的miRNA靶基因总体鉴定
两个降解组文库分别获得大约27.9（LS）和27.6（SS）millioncleanreads，对应13millionuniquesequences，最终分别有59.14%和62.10%能映射到转录本参考上；共鉴定出个预测的裂解事件，包括33个已知miRNAs的个和58个新miRNAs的个（表3）。共个转录本被鉴定为被剪切转录本，代表了LS中的个基因和SS中的个基因，已鉴定的这些目标基因分类到Category0和2的明显较多，而Category3的则比较稀有。
大多已知miRNAs有Category0的裂解产物，这些靶基因也被发现是很多其它植物物种中的保守靶基因。此外，一些已知miRNAs似乎能靶向1或多种非保守的靶基因，其中靶向最多来自不相关家族基因的miRNA就是miR，共鉴定出77个靶基因。而新miRNAs只在特定物种中被发现且与它们相应的靶基因一样累积水平很低。与已知miRNAs相比，新miRNAs的靶基因在中表现出低的剪接频率，且大多数预测的靶基因属于Category2-4（表4）。
表3.降解组测序分析确认的裂解事件
表4.两个降解组文库中miRNA靶基因概述
5.预测靶基因的实验验证
RLM-RACE结果显示MYB65，ARF10和ARF17，NAC1和CUC2可能分别由miR、和裂解（图4）。另一方面，F-box家族基因的裂解产物与novel_mir_43有靶向关系；靶向CUC1的novel_mir_65和novel_mir_80，也被证实与miR几乎完美匹配。
图4.通过RNA连接酶介导的5’RACE映射mRNA的剪切位点
6.角果发育过程中miRNAs及其靶基因表达模式的分析
通过对角果不同发育阶段miR、、、和novel_mir_11及相关靶基因的表达进行qRT-PCR分析，结果证明了miRNAs在角果发育中的动态表达，表明它们可能在角果发育中起到关键作用（图5）。
图5.挑选的5个miRNAs及其靶基因在SS株系0-7DAP角果中丰度的qRT-PCR分析
7.miR的异位表达影响植物角果发育
构建miRsensor转入Arabidopsis发现GUS信号在0-7DAP中几乎检测不到或与阳性对照相比显著降低，暗示miR确实在角果中有活性；且一些转入miRsensor的植物与阳性对照和野生型植物相比角果更短。qRT-PCR也证实了miR的靶基因在角果中升高（图6）。因此，推测miR能通过ARFs影响角果发育。
图6.拟南芥中构建的miRsensor的生物活性
进一步构建miR的过表达载体转入B.napuscv.J中发现过表达与空载株系相比有更长的角果（图7）。qRT-PCR结果显示miR在转基因植物角果中强烈表达，表明角果中miR活性增强。相反的，35S：MIR株系和野生型相比ARF10，ARF16和ARF17的表达大幅降低（50-90%）。
图7.bna-miR过表达转基因植物的表型
图8.角果发育中潜在的miRNA调控网络
总结
总的来说，本文鉴定了油菜角果中个miRNA前体，其中个代表了65种已知miRNAs，另外个代表了种新的miRNA。此外，涉及多种功能的个转录本预测能被33种已知miRNA和58种新miRNA降解；这能进一步促进油菜中miRNAs介导的基因调节的功能研究。更重要的是，miRNAs及其靶基因间的相关表达证明，由miR，miR和miR分别调节的MYBs、TCPs和ARFs转录因子可能控制细胞增殖或植物生长素信号转导来调控SL；而且miR，miR和miR反应的缺乏Pi/Cu也会限制角果发育。此外，表现出调节RPS3的novel_mitr_11可能抑制细胞增殖（图8）。而且，本文已经证实miR在角果中活跃表达调节植物生长激素转导。
美格基因miRNAs测序报告全新升级，等你来撩~
| |
